一文读懂PCR技术用应的中测检虫生寄在寄生虫检测中的应用

虽然粪便样本中寄生虫生命阶段（例如，卵、包囊、卵囊）的形态学评估通常可以帮助识别与做出明智的临床治疗和控制决策相关的分类学水平（例如，物种、属、科），但经典的寄生虫学工具具有某些物种的明确鉴定的局限性。

分子技术可以提供急需的诊断解决方案，这对于有效的寄生虫病管理至关重要。许多血清学和分子测试，例如聚合酶链反应 (PCR)，目前正用于特定的寄生虫检测。这些测试在研究/学术环境中更为常见，但也可以通过商业诊断实验室提供。

寄生虫检测的基本 PCR 方法

当形态学检测具有挑战性时，PCR 越来越多地用于确认寄生虫种类（框1）。有两种基本方法：物种特异性检测和通用检测。

框1 聚合酶链反应概述

01、它是什么？

聚合酶链反应 (PCR) 是一种用于选择性扩增（复制）双链 DNA 的特定部分的过程，该部分的侧翼序列是已知的。

02、它是如何工作的？

基本 PCR 包括 3 个步骤：

1. 模板 DNA 双链的变性

2. 引物与模板 DNA 的每条链的退火

3. 引物延伸以合成新的 DNA 链

在变性步骤中，模板 DNA 被加热到 94°C 以分离互补链。 降低温度（通常为 50°C 至 65°C）使引物与模板 DNA 上的互补靶标重组或退火。退火温度由2个引物的解链温度(T m )决定。最后一步是延伸，在此期间 DNA 聚合酶使用反应混合物（PCR缓冲液、MgCl2）。延伸温度由特定的热稳定聚合酶决定，通常在 72°C 左右。使用热循环仪将反应混合物加热至特定温度并持续设定时间和设定数量的循环（35至45个循环）。亲本 DNA 模板以指数方式扩增，因此在 35 个 PCR 循环结束时，单个模板 DNA 可以扩增 350 亿次。

物种特异性 PCR 检测

物种特异性检测允许甚至从近亲中排他性检测寄生虫物种。对于这些测试，先前的研究已经确定一个感兴趣的寄生虫物种（例如物种 X）独有的 DNA 区域。然后设计特定引物以精确扩增该区域。使用这种方法，仅 PCR 扩增即可确认寄生虫鉴定为物种 X，并且不需要对 PCR 产物进行进一步测序。这反过来又缩短了这些检测的周转时间（通常在同一天）。

通用 PCR 检测

通用检测通常会扩增 DNA 的“可变区域”（每个寄生虫独有），其两侧是“保守区域”（所有相关物种都相同）。基于保守 DNA 区域的通用引物允许扩增所有相关物种的可变区。扩增的 PCR 产物被进一步测序并针对公开可用的数据库进行搜索，以确定寄生虫的身份。这种方法可以在单个 PCR 运行中识别感兴趣的寄生虫或其他密切相关的物种。

与物种特异性检测相比，这种方法的测序要求增加了通用检测的周转时间（2 到 5 天）。通用检测中最著名的 DNA 区域（标记物）是内部转录间隔区 (ITS)、细胞色素 c氧化酶 (CO) 和 18S 小亚基 rRNA 基因 (18S)。

何时使用 PCR

在诊断寄生虫学实验室中，PCR 战略性地用于补充传统技术，主要是为了解决后者的诊断局限性。适当使用分子技术进行最终寄生虫检测取决于区分形态相似物种的需要。

例如，在猫粪便样本的硫酸锌粪便浮选试验中观察到的9~13 × 7~9 µm 包囊（图 1）可以在形态学上鉴定为贾第鞭毛虫属。由于贾第鞭毛虫包囊无法区分，因此无法进一步识别 A 到 G 的物种或组合。猫可感染十二指肠贾第鞭毛虫组合 F 和/或组合 A，后者是人畜共患疾病。1基于为β-贾第虫基因座可变区侧翼的 2 个保守区设计的引物的 PCR 测试（即通用检测）通常用于区分贾第鞭毛虫组合。

图1

图2

相比之下，Dipylidium caninum（跳蚤绦虫；图2）的卵包在形态上不同，只有一种Dipylidium物种会感染狗。 在对狗粪便样本进行显微镜检查时识别出这个卵包应该可以确认是否感染了D 犬，不需要进一步的分子分析/确认。

何时使用物种特异性 PCR 检测

物种特异性 PCR 通常用于排除或排除目标寄生虫物种，尤其是在需要更快的周转时。例如，对感染绦虫的狗进行物种特异性 PCR，以确定是否存在多房棘球绦虫（一种人畜共患物种）。E multilocularis的卵（图 3)在形态上与绦虫科的其他成员无法区分； 对这些卵的形态学诊断可以将寄生虫鉴定为绦虫科，而不是属或种。 有关所有者希望诊断实验室能够迅速识别该物种。基于 NADH（烟酰胺腺嘌呤二核苷酸氢）脱氢酶亚基 1 基因 (ND1) 中独特核苷酸区域的物种特异性 PCR 检测已被证明具有 100% 的检测特异性。

图3

其他使用特异性 PCR 的例子包括识别狗血样中的犬恶丝虫（犬心丝虫）和猫粪便中的弓形虫。针对D immitis CO1基因区域的物种特异性 PCR 测定克服了对从视觉上区分心丝虫微丝蚴与其他寄生虫的专业知识的需求。同样，在猫粪便中脱落的刚地弓形虫（一种人畜共患的原生动物）的卵囊（图 4）类似于哈蒙氏弓形虫的卵囊，后者是一种鲜为人知的猫原生动物寄生虫。基于独特的 529 碱基对重复元素的特定 PCR 检测用于明确检测弓形虫。

图4

物种特异性 PCR 的缺点是它不能检测相关寄生虫的感染。尽管有这个限制，但诊断实验室更喜欢物种特异性 PCR 来满足特定要求。

何时使用通用 PCR 检测

如果目标是更全面的寄生虫检测而不是快速周转，那么通用检测就可以派上用场。对于上述多房绦虫的情况，如果拥有者可以确信检测多房绦虫科物种的诊断优势，则存在基于CO1基因的绦虫通用检测方法。该检测是从 CO1 进化上保守的区域设计的，该区域位于一个可变区域的两侧，其提供所需的分辨率来区分的属所有成员棘球绦虫（包括Ë细粒棘球绦虫和加拿大桉）和绦虫。同样，通用 PCR（基于18S基因）用于识别犬巴贝斯虫和狗血样中的犬巴贝斯虫。血液涂片检查无法区分这 2种大型巴贝虫，通用 PCR 检测更具决定性。

调查寄生虫学

尽管缺乏许多具有兽医重要性的寄生虫的完整 DNA 序列信息，但通用 PCR 方法已经为常见寄生虫生成了急需的 DNA 标记信息，这些信息可通过公开访问的序列数据库获得。这反过来又促进了通用 PCR 的使用，作为研究诊断寄生虫学的主要工具。

一般而言，寄生虫学家采用经典技能将寄生虫鉴定范围缩小到可能的最低分类水平，并在需要时采用通用 PCR 进行特定物种鉴定。例如，5 到 6 微米的卵囊（图 5）属于隐孢子虫属。 该属有超过 26 个有效种，大多数的卵囊在形态上无法区分。浮选试验和可用的隐孢子虫酶联免疫吸附试验 (ELISA)均无助于物种鉴定。狗可能感染C canis和/或C parvum，两者都具有人畜共患的可能性。有时，其他隐孢子虫的卵囊物种可能作为假寄生虫通过狗的肠道。如果未确定物种，则无法解决隐孢子虫传播给狗主人/饲养员的真正担忧。在这种情况下，基于18S基因位点的通用 PCR 检测可以提供必要的分辨率来区分每个种类的隐孢子虫。

图5

虚假寄生

PCR 已被有效地用于解决与伴侣动物有关的寄生虫诊断挑战，例如识别狗的假寄生；也就是说，在狗的粪便中发现狗不是合适宿主的寄生虫。狗以吃其他动物的粪便而臭名昭著。

未能识别假寄生可能会导致不必要的治疗。例如，在狗粪便中观察到约 60 × 40 µm 圆线虫型卵（图 6）通常被解释为感染了犬钩虫。 如果狗吃了猫的粪便，并且将管形钩虫作为一种假寄生虫传播，那么就不可能进行物种的微观分化。从这些卵中提取 DNA 并对其进行通用 PCR 以扩增和测序 ITS-1 标记将确定寄生虫身份。同样，采用 ITS-2 PCR 将确定虚假的圆线虫类型的卵是反刍动物还是马来源。

图6A

图6B

PCR 测试的其他应用

PCR 还可用于识别/确认粪便中排空或从宿主中取出的大体寄生虫标本。例如，从狗的眼睛的前室取出的蠕虫通常被怀疑是吸吮线虫、恶丝虫或盘尾丝虫。如果样本不适合形态学，使用基于 NADH 脱氢酶亚基 5 基因 (ND5) 的通用 PCR 检测可能有助于在单次 PCR 运行中识别任何这些物种。

尸检时收集的样本也可以使用 PCR 进行检测。在这些情况下，病理学家经常寻求分子帮助来识别组织切片中的寄生虫，通常是为了确认属中的原生动物物种，例如肉孢子虫属、弓形虫属、新孢子虫属和哈蒙氏菌属，它们的组织阶段很难区分。如果通过组织学获得有关寄生虫更广泛分类的线索，则可以使用 PCR 识别许多常见寄生虫（包括蠕虫和节肢动物）。

PCR 检测的样本制备

寄生虫检测 PCR 的成功取决于各种因素，其中最重要的是用于初始 DNA 提取的样本。使用福尔马林等固定剂会削弱 DNA 链的解离，这是 PCR 扩增的必要步骤。 对于 PCR 测试，将粪便样本作为新鲜/冷藏和肉眼寄生虫在 70% 乙醇防腐剂中提交至关重要。福尔马林固定的寄生虫标本，包括石蜡包埋的组织卷，需要特殊的 DNA 提取方案，这可能会限制成功 PCR 所需的 DNA 质量。

PCR 的局限性

分子寄生虫检测不被认为是经典检测的替代方案。虽然在少数情况下用于诊断犬的先天性感染，但主要用作通过来自寄生虫阶段的 DNA 检测未发性寄生虫感染的确认试验。采用分子寄生虫学诊断的障碍很多。开发分子检测作为寄生虫检测的唯一诊断工具需要繁琐的验证过程，这超出了许多诊断寄生虫学实验室的范围和范围。更重要的是，过度诊断的风险迫在眉睫。例如，一项研究发现了弓形虫的PCR 证据没有活动性肠道感染的猫粪便中的 DNA；存在感染了寄生虫“-zoite”阶段的猎物，作为 DNA 的来源。必须谨慎解释此类结果。

结 论

与采用先进的诊断方法来检测细菌或病毒病因不同，许多临床医生将寄生虫的分子检测视为辅助性且不必要的。任何新的、先进的寄生虫学测试，即使是那些用于快速诊断的测试，都需要成本合理性和临床相关性。 谨慎使用分子进步来增强经典识别方法以有效满足临床医生的诊断需求。

宠物健康：如何诊断、治疗猫弓形虫病

由于现在很多宠主不注意宠物们的养护工作，所以也就导致了宠物们很多疾病的发生；比如弓形虫病，弓形虫病是比较常见的人畜共患病，也就是说，这种疾病不仅会给宠物带来很大的危害，也会给人类的健康带来一定的影响；而猫咪作为弓形虫的终末宿主，如果不注意养护和定期进行驱虫的话，其感染率还是比较高的。

在文章正式开始之前我们先分享一个知识点：虽然很多人对弓形虫都是“谈虫色变”，认为弓形虫就是从宠物的身上传到人类身上去的，因为弓形虫对妇女和宝宝是有很大危害的，所以这也就直接导致了很多人对宠物“趋之如骛”。

其实大可不必担心，喵大夫在前两天的文章中已经明确地将“宠物是人类感染上弓形虫主要传播途径”这一说法“辟谣”了，而且华西医院的医生也明确指出了宠物并不是人感染上弓形虫的主要途径。

虽然从多方面已经论证了“宠物并不是人类感染上弓形虫的主要途径”， 随着流浪动物数量的上升和很多宠主不注意宠物的养护，在这样的一个条件下，弓形虫还是会有很大的几率感染上宠物的，特别是弓形虫的终末宿主——猫。

弓形虫和猫（示意图）

今年三月的一个晚上，一位宠主十分焦急地带着一只大约2岁的未绝育的中华田园猫来宠物医院就诊，在就诊的时候了解到，这只猫咪是宠主一年前在公园里收养的流浪猫，因为当时考虑到猫咪还小和对环境还不熟悉，也就没有给猫咪进行绝育。

在将猫咪带回家的几个月后，猫咪因为发情跑出去过一回，但是在几天后又回家了，回家的同时猫咪也没有发情的迹象了，于是宠主当时就怀疑猫咪可能配上了。

因为是住在城郊，所以宠主几乎就是将猫咪进行“敞放”，并没有像城市那样对猫咪进行“圈养”，于是猫咪几乎每天都会跑出去玩耍，但是自己也知道“按时”回家。

在猫咪发情后的二十几天左右，宠主就将猫咪带去找了一位养宠经验比较丰富的宠主帮忙看一下猫咪是否怀孕了，经过这位宠主的经验分析，猫咪确实怀孕了，宠主在高兴之余，却也为即将生下来的小猫咪该如何安置的问题而惆怅。

但是就在猫咪怀孕后的大约三十天左右，猫咪的精神也没有以前那样好了，被毛也逐渐变得比较蓬乱且无光泽，食欲也逐渐下降了，当时宠主以为猫咪只是受了点刺激，便只是给猫咪买了点营养品吃。

可是在几天后，猫咪的状态不仅没有变好，还变得越来越差，眼睛还出现了很多黄色的分泌物，偶尔还会出现呕吐的现象，在当天下午，猫咪外阴还出现了带有腥臭味的分泌物，在晚上回家后，宠主看到猫咪的状态越来越差，于是就将猫咪带来了宠物医院进行就诊。

当时接诊的医生对猫咪进行了基础检查后，结合主述，便判断猫咪可能是出现了流产，在检查的时候发现猫咪的体温竟然升高到了40℃（猫正常体温为38-39.5℃），经过B超检查到，猫咪腹中的胎儿也没有生命迹象，由于检查到猫咪的产道比较狭窄且无法自主排出胎儿，于是就和宠主协商对母猫进行剖腹产将胎儿取出。

通过剖腹产将胎儿取出来后，发现三只胎儿已经全部死亡，且同时还发现母猫的腹部出现了淤血的现象；就在众人觉得这就是一例比较常见的母猫流产病例的时候，一位比较有经验的宠医结合主述和猫咪的临床症状便怀疑猫咪可能是被弓形虫感染了，随即告知宠主后，便对母猫进行了弓形虫试纸板检查和血涂片检查。

血涂片显示有滋养体包囊存在（蓝色状）

弓形虫试纸板检测显示弓形虫阳性感染

经过进一步的检查发现，弓形虫试纸板检查呈阳性反应，且在血涂片上也发现了弓形虫包囊的存在，毫无疑问，这两个检查的结果都进一步说明了猫咪被弓形虫感染了，这也进一步说明了母猫是由于弓形虫感染而出现的流产和胎儿死亡。

由于此病例发现的比较及时和宠主也愿意积极治疗，在对猫咪进行对症、对因治疗和支持性治疗半个月后，猫咪也逐渐恢复了健康。

通过上面这个病例相信铲屎官们已经对猫咪弓形虫病已经有了一个初步的认识，为了便于各位宠主在遇到猫咪患病的时候能够采取正确的应对措施，本文将从以下几个方面对猫弓形虫病进行分析：

1. 什么是弓形虫病？
2. 导致猫患弓形虫病的原因是什么？
3. 弓形虫的生命周期。
4. 猫患病时的临床症状是什么？
5. 如何诊断猫弓形虫病？
6. 如何治疗猫弓形虫病？
7. 如何预防猫弓形虫病？

弓形虫的速殖子阶段

何为弓形虫病？

在1908年的时候，一位法国的学者和他的同事在研究野生动物的时候，从一种鼠类的体内发现了一种形态类似利什曼原虫（以沙蝇为传播媒介，主要寄生于脊椎动物体内，会引起利什曼病的一种寄生虫）的寄生虫，在对这种寄生虫进行仔细研究后，1909年正式将其命名为“弓形虫”，直至 研究者们在全世界大约100种生物体内都发现了弓形虫虫体的存在。

猫弓形虫病是由一种叫做“龚地弓形虫”的病原体所导致，弓形虫属于原虫寄生虫，弓形虫病的特点就是当患者感染上弓形虫的时候，虫体就会寄生在中间宿主体内的所有的有核细胞内，同时弓形虫也是一种细胞内寄生的寄生虫。

猫弓形虫病对猫的健康影响比较大，且对猫的呼吸系统、神经系统以及生殖系统都会造成不同程度的伤害。

弓形虫

猫弓形虫病的病因分析

1、流浪动物的数量增多

由于流浪动物的生存环境比较复杂，所以当它们以生肉、老鼠以及蟑螂等当做食物来源的时候，很可能就会增加弓形虫的感染几率，当家养动物接触到这些流浪动物的时候，可能就会被感染。

2、宠物主人对猫弓形虫病的认知不足

虽然很多猫咪在一生中被弓形虫感染的几率较小，但是往往也会让很多的宠主不会意识到猫咪在弓形虫传播途径中所扮演的角色，这也导致了很多宠主对其采取直接忽视的态度，因此很多宠主就会忽略对弓形虫的预防。

3、人为因素

相信很多人在选择养猫的时候都会去宠物市场购买，但是由于现在的宠物市场比较复杂，且一些“无良”的宠物卖家可能就会用患病的猫咪蒙混过关，因为弓形虫是可以进行垂直传播的，所以很多卖家在购入或繁殖小猫的时候，不对小猫进行弓形虫检测，这也为猫弓形虫感染和传播弓形虫病埋下了“种子”。

4、食物因素

我们知道，猫和猫科动物是弓形虫的唯一终末宿主，而猪、老鼠、蟑螂以及鱼类等动物都是中间宿主，当猫咪长期把这些中间宿主当做食物的时候，可能就会增加猫咪感染上弓形虫的几率。

弓形虫的生命周期

在弓形虫的发育过程中需要经过两个宿主，即终末宿主和中间宿主，猫和猫科动物就是弓形虫的终末宿主，人类、犬、老鼠、蟑螂以及鱼类等都是弓形虫的中间宿主。

弓形虫的整个生命周期都是在中间宿主和终末宿主的体内完成的，在中间宿主内属于组织细胞内循环，没有自己发育和繁殖的能力，属于无性生殖；在终末宿主内就属于肠道上皮细胞内循环（因为主要寄生在猫咪的肠道上皮细胞内），弓形虫在终末宿主内可以自行发育和繁殖，所以就属于有性生殖。

通常弓形虫在宿主体内的发育过程中主要有5种不同的形态，即滋养体、包囊、裂殖体、配子体和卵囊，其中滋养体和包囊主要寄生于中间宿主的细胞内，裂殖体、配子体以及卵囊主要寄生于终末宿主的肠道上皮细胞内。

弓形虫的生命周期之所以比较复杂，是因为在其发育过程中通常会涉及到两种类型的宿主；当猫咪摄入了被病原体感染的生肉或其他食物的时候，病原体就会从猫咪摄入的食物中释放到消化道中，然后在猫咪消化道中发育并逐渐繁殖出卵囊。

然后在3-10天后，卵囊就会随着猫咪的粪便被排出体外，并持续排10-14天，刚被排出的卵囊并没有感染能力，在合适的环境条件下，这些卵囊必须经过一个孢子形成的过程，24h后才会发育成具有感染性的卵囊。

值得注意的是，这些卵囊有着非常强的耐寒能力，但是不耐高温（75℃就可以将其杀死），如果在适宜的环境下，它可以存活一年以上。

当猫咪摄入被病原体感染了的食物的时候，这些肉类中释放出来的弓形虫就会更深地渗透到猫的肠壁中去并繁殖出弓形虫的另一种形式，即速殖子，然后这种形式的弓形虫就会逐渐蔓延到猫咪的其他组织器官，最终，猫咪的免疫系统就会迫使寄生虫进入“休眠”阶段；然后就会逐渐发育成另一种形式的弓形虫，即缓殖子。（有关弓形虫生命周期的说明，请参考下图）

猫被弓形虫感染的临床症状分析

由于弓形虫大多时候会呈现隐性感染，所以大多数被弓形虫感染的猫咪在初始阶段不会出现任何临床症状； 在有时候当猫咪被感染后也会出现比较明显的临床症状，这些临床症状通常是发生在猫的免疫系统不能阻止速殖子的发育时，更常见于发生在免疫系统受到抑制的猫咪身上，比如当猫咪感染了白血病病毒（FeLV）和免疫缺陷病毒（FIV）。

猫弓形虫病常见的临床症状包括发高烧、食欲不振、精神萎靡、被毛粗乱、呕吐以及淋巴结肿大，根据弓形虫感染是属于急性还是慢性，以及寄生虫在体内寄生的位置，还可能会出现其他症状。

当虫体在肺部的时候可能会导致猫咪出现肺炎，逐渐会导致呼吸困难；当虫体存在于肝脏的时候，就会导致皮肤和粘膜发黄，即“黄疸”。

弓形虫病还会影响患病猫咪的眼睛，从而导致患者出现葡萄膜炎、视网膜或晶状体和角膜之间的空间变大、瞳孔大小比例变得异常以及对光线敏感，甚至是失明。

弓形虫病还会影响猫咪的中枢神经系统（CNS），从而导致患者出现身体缺乏协调性、对触觉敏感度增加、性格改变、原地转圈、癫痫发作以及耳朵抽搐等症状。

怀孕的猫咪则会出现流产、死胎以及胎儿畸形等症状，同时可能还会将疾病通过垂直传播传染给幼猫。

弓形虫所导致猫咪眼睛出现了葡萄膜炎

如何诊断猫弓形虫病？

通常可通过猫病史、临床症状以及基础检查对疾病进行初步诊断，但如果需要确诊， 要进一步进行实验室诊断。

a、可通过动物弓形虫试纸板进行初步检测，如果检测结果呈阳性的话，则代表猫咪可能被弓形虫感染。

b、可采取静脉血液做血液涂片，然后经过瑞士染色，如果在显微镜下发现由滋养体形成的包囊的话，则代表猫咪可能被弓形虫感染；同样也可对胸水和腹水采样进行镜检。

c、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验以及PCR也可用来检测抗原或特异性IgG和IgM抗体，如果猫咪体内存在高水平的IgG抗体则表明该猫先前已经被弓形虫感染，而且自身机体可以对其免疫并且不会排出卵囊，这些猫也不是其他宿主的感染源；相反，如果存在高水平的IgM，则表明猫咪正处于比较“活跃”的寄生虫感染阶段。

d、虽然可以检测粪便中卵囊进行诊断，但这并不是一种可靠的诊断方式，因为弓形虫的卵囊和其他常规肠道寄生虫有很大的相似性。

如何治疗猫弓形虫病？

虽然就目前而言，对治疗弓形虫没有特效药，但是磺胺类药物对治疗弓形虫病有着比较好的效果，临床上通常会使用磺胺嘧啶或甲氧苄氨嘧啶、乙胺嘧啶、克林霉素、克拉霉素联合或单独用药，为了防止使用磺胺类药物导致猫咪出现结石，还应该同时使用碳酸氢钠碱化尿液。

如果猫咪正处于妊娠期或有眼睛病变出现的话，可使用螺旋霉素；如果眼睛或中枢神经系统有明显的炎症，还可联合使用皮质类固醇。

在对症、对因治疗的还应该采用支持疗法以避免继发感染。

预后：猫弓形虫病的预后效果主要取决于受影响的器官、发现和治疗时间以及患者对治疗的初始反应，一般来说，中枢神经系统和眼睛受损的猫对治疗反应较慢，但是预后较好；如果弓形虫病已经影响到患者肺部和肝脏的话，预后较差。

如何预防猫感染上弓形虫？

虽然弓形虫对猫的健康影响较大，但还是完全可以通过以下措施进行预防：

• 保持猫咪生活环境的清洁，定期对环境进行消毒。
• 应避免长期给猫咪吃未煮熟的肉，特别是生肉、生鱼以及动物内脏。
• 避免家猫外出和流浪猫接触，同时还应该避免猫咪常吃老鼠。
• 可对猫进行弓形虫疫苗免疫。

其实只要树立了正确的、科学的养宠观念，弓形虫就不会那么容易感染上猫咪。

（本文图片来源于网络，侵删）#萌宠小戏精#

作者：一个小兽医，致力于守护萌宠健康，保障动物福利，关注我，每天分享宠物那些事儿！